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使用Infinite200酶标仪测定核酸浓度的方法
一、光吸收法
DNA的紫外吸收高峰为260nm，吸收低峰为230nm，而蛋白质的紫外吸收高峰为280nm。
如OD260nm/ OD230nm≥2，OD260nm/ OD280nm≥1.8，表示RNA 已经除净，蛋白含量不超过0.3％。
用这种方法适合测定GC含量比较均匀的基因组DNA，人工合成的寡核苷酸如果CG含量过大或者过小，就不能采用此方法。
双链DNA浓度的计算：
OD260nm为260nm 处的光吸收值；L 为光程（cm）；0.020 为1μg/mL DNA 钠盐的光密度。
由于这种方法无法区分核酸种类和核苷酸，故此对于不纯的样品准确性不高，如果需要精确定量双链DNA的浓度，请采用荧光染料测定DNA的方法。
（一） 使用酶标板：
优点：通量大；
缺点：不易获得准确的光程；需要较高的样品浓度和较大的样品体积。
使用酶标板检测DNA，必须使用能够透过紫外光的UV板，普通酶标板是不能使用的。
市场上常见的两个品牌Costar和Greiner都有UV板，它们是有区别的：Costar的UV板只能做260nm-280nm的光吸收检测，波长低于260nm时板的本底光吸收会随波长降低不断增加；Greiner的UV Star板在230nm-280nm范围内吸收值大致相同，故此可应用范围更宽泛。
UV板在260nm有大约0.05OD的光吸收，按100ul的检测体积计算，相当于10ug /ml dsDNA，按照酶标仪检测的一般原则，样品的OD值需要为本底的3倍以上才可信，就是核酸样品的260nm光吸收值必须大于0.150OD，这样就要求100ul核酸样品的浓度不低于30ug/ml，如果检测体积减小，这个浓度还需要继续加大。
图1：Costar96孔UV板的光吸收谱
1、酶标板的选择：
DNA样品的体积一般是有限的，如果过度稀释将无法在酶标仪上检测。要避免过度稀释，可使用384孔UV板进行检测，需要15ul-20ul样品直接检测或稀释数倍后检测，也可使用half area 96孔UV板进行检测，需要20ul-80ul的样品，样品浓度仍需大于30ug/ml。
Costar和Greiner都提供384孔和half area 96孔UV板：
384：Greiner UV-Star Cat.No. 781801；Costar UV Cat.No. 3675；
Half area 96：Greiner UV-Star Cat.No. 675801；Costar UV Cat.No. 3679。
其中我们推荐使用Greiner UV-Star 96孔Half area板，因为它是一种可确定光程的板，80ul样品的光程是0.5cm，170ul样品的光程是1cm。此种板国内一般无库存，需要提前订货。
图2：Greiner UV-Star 96Well Half area 的几何尺寸
2、光程的确定
光程就是测定时光线穿过样品的距离，它与测量获得的光吸收值（OD值）成正比，要计算核酸浓度，必须知道测量的光程。由于酶标板的孔一般是半圆锥型的，上下截面的直径是不等的，所以使用酶标板测量DNA时，样品的光程是难以计算的。
常用的酶标板光程计算，是利用水在977nm或998nm下的吸收峰，来计算水溶液的光程。水在977nm-998nm有吸收峰，在900nm几乎无吸收。先利用分光光度计测出1cm光程的水在977nm或998nm和900nm的光密度差，再与酶标板上测得的差值比较，就可以估算出每个孔的光程了。
下面是光程计算公式：
A977：水溶液样品在977nm的吸光值
A900：水溶液样品本底
Awatercm-1：1cm光程比色杯中水的吸光度值（ A977 ）－本底值（ A900 ）
光程测量法只能在光栅型酶标仪上使用，比如Infinite M200/M1000，由于水在977nm或998nm 下的吸收值本来就不大，这种方法误差相对来说就比较大。
也可以采用标准曲线法计算样品浓度从而避免测量光程；或者采用某个已知浓度、特征吸收峰和光密度的样品去估算光程（可以和分光光度计的测值比对，或者通过核酸浓度进行换算）。
（二） 使用比色皿：
优点：对样品浓度的要求低；
缺点：需要较大的样品体积，通量低。
如果M200酶标仪具有比色杯模块，可使用微量石英比色皿测定样品核酸浓度。由于M200的比色杯模块测量狭缝的尺寸限制，样品体积一般不能低于100ul，光学性能好的石英比色皿260nm本底吸收在0.01-0.04OD，大约相当于0.5-2.0 ug /ml dsDNA，低浓度的DNA样品可测量。
如果酶标仪不具备比色杯模块，也可以使用卧式微量石英比色皿来检测DNA，Tecan的酶标仪配置了卧式比色皿的适配器，但卧式比色皿需要的样品体积较大，需要200-400ul。
（三） Nanoquant板
优点：需要样品少，通量较大；
缺点：样品浓度不可过低。
NanoQuant是Tecan公司开发的利用Infinite200酶标仪光吸收测量功能检测微量体积（2ul）核酸样品的工具模块，样品不需要稀释直接检测，每次最多可检测16个样品。
NanoQuant板在260nm的本底吸收约为0.05OD，NanoQuant模块的检测下限为1ug /ml dsDNA。
NanoQuant模块包括NanoQuant板一块、辅助加样器一个。
图3：NanoQuant模块
Nanoquant模块的使用方法另作详述。
二、荧光法
使用与核酸结合的荧光染料测定DNA。荧光方法灵敏度高，特异性好，如PicoGreen灵敏度可达250pg/ml，能区分DNA和RNA，区分核酸和核苷酸，需要样品量少。荧光法的缺点是需要做标准曲线，荧光染料需要一定的成本，得不到A260nm/ A280nm值。
常用染料品种：
PicoGreen：Invitrogen生产的dsDNA定量染料Kit：（Molecular Probes P-7589)。
SYBRGreen I：激发波长497nm，发射波长520nm，用于核酸凝胶电泳染色和荧光定量PCR，价格便宜，直接用于酶标检测DNA本底较PicoGreen高，灵敏度需实验确定。
附：
DNA的SYBR Green I荧光定量方法
原理： SYBR Green I荧光染料与 DNA双链具有高亲和力，结合后荧光强度可增加800-1000倍；在溶液中SYBR Green I过量时，荧光强度与双链DNA浓度成正比。因此可用于溶液中 dsDNA 的定量，为核酸的高灵敏度检测提供了一种新的方式。
方法：
1. 将SYBR Green I储存液（10000×，Molecular Probes，catalog number S7563）用DMSO稀释至200×，再用1×TE（10mM Tris-Cl，1mM EDTA，pH 7.5）稀释至2×；
2. DNA标准品的稀释：已知浓度的纯化的DNA均可作为标准品。将标准DNA稀释为三个浓度：10ng/ml，100ng/ml，1000ng/ml。若能根据经验估计出待测样品DNA的大致浓度，则省去4-6步。
3. 待测DNA的稀释：将待测样品用1×TE进行梯度稀释，稀释2-3个浓度。
4. 加样：黑色平底96孔板（GREINER，）的每孔中加入100μl 2×SYBR Green I和100μl标准品稀释液（或待测DNA稀释液，以TE代替样品作为空白对照），混匀；室温避光孵育2-5分钟。
5. 放入TECAN多功能酶标仪中，设置好参数进行测量，测量结果保存，进行数据分析。
6. 根据减去背景后的荧光值估计出样品DNA的大致浓度（荧光值与浓度成正比），将标准DNA在适当范围内进行梯度稀释。
7. 重复4-6步测量。
注意事项：
1. 标准DNA和样品的稀释度均应在1×SYBR Green I测量的线性范围内(10-1000ng/ml)，否则测量结果不准确；样品浓度在1-10ng/ml范围内时，用终浓度为0.2×的SYBR Green I测量；DNA浓度<1ng/ml时，不宜用SYBR Green I方法测量。
2. SYBR Green I的稀释应在塑料容器中进行，不要在玻璃容器中进行，因为玻璃表面可吸附染料；SYBR Green I见光易分解，因此工作液要避光，而且在稀释后的几个小时内尽快用完，不要长期保存。
3. 用来作标准曲线的DNA与待测DNA的纯化方式应尽量相同，以确保溶液内其他组分（盐、有机溶剂、蛋白等）一致，使测量准确。
4. 较高的样品DNA稀释浓度可减小其他污染（盐、有机溶剂、蛋白等）的干扰。
准备的试剂：SYBR Green I（200×）100 μl
1. 根据用量将SYBR Green I用蒸馏水稀释至1×。
2. 加样：每孔加入90μl 1×SYBR Green I和10μl待测样品溶液或标准品溶液，先根据标准品浓度判断样品的大体浓度范围。若样品浓度很低（1－10ng/ml）则用0.2×SYBR Green I测量。
