转基因技术的发展与转基因动植物
1.转基因技术的发展
自从人类学会蓄养动物、耕作植物以来，我们的祖先就从未停止过对物种的遗传改良。过去的几千年里改良物种的主要方式：针对自然环境造成的突变或无意的人为因素所产生的优良基因和重组个体进行选育和利用，从而通过随机和自然的积累优化基因。然而这种极低几率且无人类控制性的被动模式大大阻碍了农业的发展，迫切地需要一门新兴科学。自遗传学创立后改观了这一境遇，动植物育种采用人工杂交的方法进行优良基因的重组和外源基因的导入，从而实现遗传改良。
因此，转基因技术与传统技术在本质上都是通过获得优良基因进行遗传改良。但在基因转移的范围和效率上，转基因技术与传统育种技术区别于两点：首先，传统技术一般只能在生物种内个体间实现基因的转移，而转基因技术所转移的基因则不受生物体间亲缘关系的限制；第二，传统的杂交和选择技术一般是在生物个体水平上进行，操作对象是整个基因组，所转移的是大量的基因，不可能准确地定位于某个基因进行操作和选择，对后代的表型预见性较差。而转基因技术所操作和转移的是经过明确定义的基因，功能清楚，可准确预测后代。故转基因技术是对传统技术的发展和补充，两者的结合可以极大地提高动植物品种改良的效率。
在转基因发展的过程中，从早期单纯进行科研研究拓展到目前研究和应用齐头并进，生物学科与其他领域的交叉有着不可忽略的重要作用，如生物物理产生的显微镜技术，以及日益发展的电穿孔技术，极大地促进了科研走向应用。
在当今转基因领域中电穿孔技术的应用范围最广，早在1982年Neumann.E将外源DNA在电场条件下导入小鼠真核细胞[1]，从而实现了基因重组和外源基因的功能研究。随之这一技术得到了广泛的运用，如细菌、酵母、植物和动物细胞的体外应用如Simon, J. R[2]；以及器官植入、皮肤损伤修复的电化学疗法、疫苗的注射等体内体外临床应用，如S.Tollefsen, et al[3]；小分子或大分子物质功能性研究；研制转基因动物、转基因植物新品种等，本文下文就将特别介绍转基因动植物的应用。
电穿孔技术主要包括电转染和电融合：电转染是利用脉冲电场将外源DNA导入细胞中，当细胞处于高压电场时，瞬时电脉冲可将细胞膜穿孔产生可逆性孔径，从而DNA进入细胞与染色体整合；电融合是利用高强度的电场脉冲，引起相邻的细胞融合。
电穿孔技术的简单原理与应用如下图。
图1：电穿孔前后细胞质膜的变化示意图
图2：电穿孔原理和应用示意图
2.转基因动物
1981年，第一次成功地将外源基因导入动物胚胎，创立了转基因动物技术。1982年获得转基因小鼠，转入大鼠的生长激素基因，使小鼠体重为正常个体的二倍，因而被称为“超级小鼠”，这些开拓了转基因克隆动物–无性生殖技术。1997年英国I. Wilmut等，用绵羊乳腺细胞的细胞核移植到去细胞核的卵细胞中，成功得到了克隆羊“多莉”，证实了高等哺乳动物也可以突破有性生殖繁殖后代。
核显微注射法则是动物转基因技术中早期最常用的方法。它是在显微镜下将外源基因注射到受精卵细胞的原核内，注射的外源基因与胚胎基因组融合，然后进行体外培养，最后移植到受体母畜子宫内发育，这样分娩的动物体内的每一个细胞都含有新的DNA片段。然而这种方法的缺点是效率较低、位置效应(外源基因插入位点随机性)造成的表达结果的不确定性、动物利用率低等，在反刍动物还存在着繁殖周期长，有较强的时间限制、需要大量的供体和受体动物等特点。
体细胞核移植是近些年来新出现的一种转基因技术。该方法是先把外源基因与供体细胞在培养基中培养，使外源基因整合到供体细胞上，然后将供体细胞细胞核移植到受体细胞——去核卵母细胞，构成重建胚，再把其移植到假孕母体，待其妊娠、分娩，便可得到转基因的克隆动物。在这一技术中，外源基因的稳定表达和重建胚的良好发育是关键因素，则选择合适的基因转染方式和细胞融合方式就显得尤为重要。
与传统的方法相比，电穿孔具有很多优点。首先，不必像显微注射那样使用玻璃针，不需要技术培训和昂贵的设备，可以一次对成百万的细胞进行注射。第二，与用化学物质相比，电穿孔几乎没有生物或化学副作用。第三，因为电穿孔是一种物理方法，较少依赖细胞类型，因而应用广泛。实际上，对大多数细胞类型，用电穿孔法基因的转移效率比化学方法高得多。已有多篇科研文献证实了电穿孔技术在转基因研究和临床研究上的作用，如Diego Laderach, et al[4]使用BTX ECM830以方波波形电击DC细胞，转染siRNA研究体内定位基因的功能，类似这种用以研究某基因的方法已相当成熟；以及Annelies E.P, et al[5]运用BTX ECM2001交流电排列细胞和直流电进行电击达到了目的基因的稳定表达和胚胎细胞的良好融合，最终得到转基因牛，等等。而BTX ECM2001细胞电融合&电穿孔仪已被美国权威实验室冷泉港列入标准实验操作程序。
转基因动物可以建立多种疾病的动物模型，进而研究这些疾病的发病机理及治疗方法，而电穿孔技术的应用可以针对性地制备抗性药物；以及通过与化学学科的交叉，利用电化学疗法注射抗癌药以治疗皮肤型肿瘤疾病。转基因动物技术配合电穿孔技术还可以改造动物的基因组，使家畜、家禽的经济性状改良更加有效，如使生长速度加快、瘦肉率提高，肉质改善，饲料利用率提高，抗病力增强等。对于动物遗传资源保护的意义更加深远，对挽救濒危物种是必不可少的。
3.转基因植物
近些年来，面对全球环境剧变所引发的诸多农业问题，如耕地面积减少、空气质量下降等造成早期改良品种的方法已不合时宜，迫使转基因技术充分考虑各种因素，以达到人口不断增加对植物包括粮食及其他食品的需求。基因工程应用技术之一的基因重组，可用于不同生物遗传物质进行体外人工剪切、组合、拼接，使遗传物质重新组合，然后，通过载体，如微生物、病毒等转入微生物或细胞内，进行"无性繁殖"，并使所需基因在细胞内表达出来，产生人类所需的物质或创造新的物种。
近年来，国外已出现了一些"转基因作物"，如抗腐烂西红柿、抗除草剂棉花、抗病毒黄瓜和马铃薯，以及抗虫玉米等。这些都是运用转基因技术将目标基因转入受体植物体内，可用电转染方法、基因枪或者是传统的农杆菌侵染等。基因枪方法的效率较高但是价格昂贵；传统的农杆菌侵染易污染且效率低，外界不确定因素较多；相比较，大多数研究使用电转染方法获得转基因植物，如在James Saunders等利用BTX630电转仪得到转基因大豆[6]。
转基因植物可通过原生质体融合获得，有可能改变植物的某些遗传特性，不仅可以改良作物特性，还可培育高产、优质、抗病毒、抗虫、抗寒、抗旱、抗涝、抗盐碱、抗除草剂等的作物新品种。而且可用转基因植物或离体培养的细胞，来生产外源基因的表达产物，如人的生长素、胰岛素、干扰素、白介素2、表皮生长因子、乙型肝炎疫苗等已在转基因植物中得到表达。
结束语：
转基因技术的不断发展极大地促进了转基因领域的理论研究和实际应用，特别是极大推动了转基因动植物新品种的培育。而我国已启动了“转基因生物新品种培育”科技重大专项，随着这些科研成果转化为生产力，必将大大促进中国社会经济的发展。
参考文献：
【1】Neumann, E., Schaefer-Ridder, et al. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J,1982;1:841–845.
【2】Simon, J. R. Transformation of intact yeast cells by electroporation. Methods Enzymol,1993;217: 478–483.
【3】S.Tollefsen, et al.DNA injection in combination with electroporation: a novel method for vaccination of farmed ruminants. Scandinavian journal of immunology,2002;57：229-238.
【4】Diego Laderach, et al.RNA Interference Shows Critical Requirement for NF-kβ p50 in the production of IL-12 by Human Dendritic cells.The Journal of Immunolgy,2003;1750-1757.
【5】Annelies E.P,et al.Nuclear Transfer and Electrofusion in Bovine In Vitro-Matured/In Vitro-Fertilized Embryos: Effect of Media and Electrical Fusion Parameters.Molecular Reproduction,1993;36:307-312.
【6】James Saunders,et al.Rapid optimization of Electroporation Conditions for Plant Cells,Protoplasts and Pollen.Molecular Biotechnology,1995;3:181-190.
参考网站：
有大量转基因应用实验程序和文献可下载
东胜创新公司 李倩倩 2009－10－29
